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Forschung


Unsere Arbeiten konzentrieren sich auf zwei Schwerpunkte:

Kleine regulatorische RNAs und Transkriptionsfaktoren in Gram-positiven Bakterien

 

SR1 für homepageKleine regulatorische RNAs

Trans-kodierte Antisense-RNAs SR1 und SR2 (BsrF) aus B. subtilis

Der erste Schwerpunkt ist die Suche nach und Charakterisierung von kleinen regulatorischen RNAs aus dem Bacillus subtilis-Genom. Dabei haben wir durch eine bioinformatische Suche in Verbindung mit Northern- blot-Experimenten zwei neue kleine RNAs - SR1 und SR2 - in intergenischen Regionen des B. subtilis-Chromosoms gefunden. SR1 ist 205 nt lang, nicht essenziell, bei Überexpression nicht toxisch für das Wachstum von Bacillus und hat eine Halbwertszeit von 3-4 min. Die SR1-Expression wird unter glykolytischen Bedingungen reprimiert und unter gluconeogenetischen Bedingungen induziert. Mittels 2 D-Protein-Gelelektrophoresen und Northernblotting konnten die ersten sekundären Target-Gene von SR1, und zwar die Operons rocABC und rocDEF, die am Argininabbau beteiligt sind, identifiziert werden. Wir haben zeigen können, dass das primäre Target von SR1 die ahrC-mRNA ist, die für den Transkriptionsaktivator der roc-Operons kodiert. SR1 und ahrC-mRNA verfügen über sieben komplementäre Regionen A-G, die im 3'-Teil von SR1 und im zentralen Teil von ahrC-mRNA liegen und die ahrC-SD-Sequenz nicht einschließen. Eine Kombination von Sekundärstrukturkartierungen des SR1-ahrC-Komplexes und Toe-printing-Versuchen zeigten, dass durch komplementäre Basenpaarung zwischen SR1 und ahrC-RNA eine Strukturveränderung downstream der ahrC-SD-Sequenz induziert wird, die zur Inhibition der SR1-Translation führt. Die Menge an ahrC-mRNA wird durch SR1 nicht beeinflusst. Das abundante RNA-Chaperon Hfq beeinflusst weder die Halbwertszeit von SR1 noch die SR1/ahrC-Interaktion, sondern wird für die effiziente Translation von ahrC-mRNA benötigt.

Microarray-Analysen ergaben als weiteres Target von SR1 das gapA-Operon. Überraschenderweise wirkt SR1 hier nicht als basenpaarende Antisense-RNA, sondern als Peptid-kodierende mRNA. Somit ist SR1 die erste sogenannte dual-function sRNA in Bacillus subtilis. Die Interaktion des SR1-kodierten Peptides SR1P (39 aa) mit GapA führt auf bislang ungeklärte Weise zur Stabilisierung der gapA-Operon-mRNA. Die Ursache für diese Stabilisierung wird gegenwärtig untersucht. Dabei sollen zugleich die Interaktionsdomänen von SR1P und GapA und die Bindungskonstante beider Proteine bestimmt werden.


SR1-dual function

Bislang sind außer SR1 nur drei dual-function sRNAs bekannt, SgrS aus E. coli, RNAIII aus Staphylococcus aureus und Pel RNA aus Streptococcus pyogenes.  In diesen  Fällen spielen jedoch beide Funktionen der sRNA eine Rolle im selben Stoffwechselweg, während bei SR1 die basenpaarende Funktion im  Argininkatabolismus, die Peptid-kodierende Funktion jedoch im Zuckermetabolismus regulierend wirkt.

Die in vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Rolle der Interaktion von SR1P und GapA sind nahezu abgeschlossen. Dabei zeigt sich, dass diese  nicht auf den Zuckerstoffwechsel beschränkt ist, sondern globalere Auswirkungen hat.

23 SR1-Homologe wurden in verschiedenen Species von Bacillus, Geobacillus, Anoxybacillus und Brevibacillus identifiziert, wohingegen keine Homologe in anderen Gram-positiven oder in Gram-negativen Bakterien gefunden wurden. Eine experimentelle Analyse ergab, dass beide Funktionen von SR1, die basenpaarende  und die peptidkodierende,  über 1 Mrd. Jahre konserviert sind.


Effekt-GapA-SR1P-degradosom

Inzwischen ist es uns gelungen, die Funktion des SR1-kodierten Peptides SR1P aufzuklären:

SR1P moduliert die "moonlighting"-Aktivität der in der Glykolyse wirkenden Glycerinaldehyd-3P-DH GapA, einer der beiden GAPDHs von B. subtilis. GapA interagiert mit den RNasen J1 (Endoribonuclease und 5'-3' Exoribonuclease) und Y (Hauptendoribonuclease in B. subtilis, membranassoziiert). SR1P fördert die Interaktion mit RNase J1 und - sowohl in vitro als auch in vivo - den Abbau von RNase J1-abhängigen RNA-Substraten. Die nebenstehende Abbildung zeigt drei Hypothesen zum möglichen Einfluss von GapA/SR1P auf das B. subtilis-Degradosom. Zum einen könnten GapA/SR1P andere metabolische Enzyme wie Enolase (Eno) oder Phosphofruktokinase (PfkA) als Gerüstkomponenten des  Degradosoms ersetzen. Zum anderen könnten GapA/SR1P RNase J2 aus dem heterodimeren Komplex mit RNase J1 verdrängen. Darüber  hinaus könnten GapA/SR1P zusätzlich zu Enolase oder PfkA Wechselwirkungen mit RNase Y oder RNase J1 eingehen.

Da SR1 und damit SR1P nur unter gluconeogenetischen Bedingungen exprimiert werden, wäre somit eine Anpassung des RNA-Abbaus an den metabolischen Zustand der Zelle möglich.


Die kleine RNA SR2 (umbenannt in BsrF) ist 110 nt lang, ebenfalls nicht essenziell sowie nicht toxisch bei Überexpression und ist im Gegensatz zu SR1 mit einer Halbwertszeit von 55 min im Komplexmedium und 30 min in Minimalmedien sehr stabil. Die bsrF-Expression wird 2-3fach durch den globalen Regulator CodY in Abhängigkeit von verzweigtkettigen Aminosäuren (Ile, Leu, Val) reguliert. Ansonsten ist BsrF in Komplex- und Minimalmedien in allen Wachstumsphasen, auch in der späten  Stationärphase, zu finden. Dabei ist die Expression in der frühen log-Phase sehr niedrig, steigt in der späten log-Phase steil an und bleibt hoch. Erst wenn die Zellen anfangen zu sporulieren, sinkt die bsrF-Expression. Interessanterweise wird BsrF in B. subtilis und in B. amyloliquefaciens mit ähnlichen Profilen exprimiert. Derzeit laufen Microarray-Analysen, um potentielle Targets von BsrF zu identifizieren.

Cis-kodierte Antisense-RNAs aus B. subtilis, die als Antitoxine wirken

Ein weiterer Schwerpunkt ist seit einigen Jahren die Untersuchung von Typ I-Toxin-Antitoxin (TA)-Systemen aus Bacillus subtilis, bei denen das Antitoxin eine cis-kodierte regulatorische RNA ist, die zur Toxin mRNA komplementär ist. Zunächst haben wir das  TA-System bsrG/SR4 aus dem B. subtilis-Chromosom analysiert. Dabei ist das Antitoxin eine kleine, 180 nt lange, cis-kodierte Antisense-RNA, SR4, die den Abbau der für das Toxin BsrG (38 aa Peptid) kodierenden 294 nt bsrG-mRNA fördert (s. Abb.). Das zeigt sich in einer 3,5-fach längeren Halbwertszeit von bsrG-mRNA in Abwesenheit von SR4 (56 min vs. 15 min). In Abwesenheit von SR4 verursacht BsrG Zell-Lyse auf Agarplatten. Ein 48 °C-Hitzeschock bewirkt eine drastische Verringerung der bsrG-mRNA-Menge. Ursache dafür ist die 3- bis 4-fach kürzere Halbwertszeit der bsrG-mRNA bei hohen Temperaturen, die durch eine Umfaltung den RNasen J1 und Y einen besseren Zugang zum Abbau der RNA gewährleistet. Damit ist bsrG/SR4 das erste temperaturabhängige TA-System. Die doppelstrangspezifische RNase III ist am Abbau der bsrG-RNA/SR4-Duplex beteiligt und schneidet die bsrG-mRNA an Position 185, 8 nt downstream vom Stopcodon des ORFs.


Fig. SR4RNase III ist jedoch - im Unterschied zu einigen anderen Systemen mit cis-kodierter Antisense-RNA - nicht essenziell für die Wirkung von SR4. Eine Untersuchung der RNasen, die am Abbau von SR4 und bsrG-mRNA beteiligt sind, ergab RNase R als Hauptexoribonucleasse. Auch RNase Y, das Pendant zur E. coli-RNase E, ist am Abbau von SR4 und bsrG-mRNA beteiligt. Dagegen fördert die Polynucleotidphosphorylase (PNPase), eine weitere Hauptexoribonuclease von B. subtilis, die Processierung von SR4-Vorläufern zur reifen RNA, hat jedoch nur marginalen Einfluss auf die Halbwertszeiten von Sense- und Antisense-RNA.
Die Sekundärstrukturen beider RNAs sowie des bsrG-RNA/SR4-Komplexes wurden durch enzymatische und chemische Strukturkartierung bestimmt und die Bindungskonstanten von Wildtyp- und verkürzten SR4 und bsrG-Paaren ermittelt.


Der Bindungsweg beider RNAs wurde aufgeklärt. Die initiale Interaktion erfolgt durch einen Loop-Loop-Kontakt zwischen dem Terminator-Loop L4 von SR4 und Loop 3 von bsrG-RNA.  Die intermolekulare Wechselwirkung schreitet dann sukzessive in Richtung Stem-Loop 3 von SR4 fort. Die beiden 5'-Loops von SR4 werden für eine effiziente Bindung der Toxin-mRNA nicht benötigt. Die SD-Sequenz von bsrG liegt in einer doppelsträngigen Region, die vier GC-bp umfasst (s. Abb.). Die Bindung von SR4 induziert eine Umfaltung in bsrG-RNA, die zu einer Verlängerung der doppelsträngigen Region von 4 auf 8 GC-bp führt. Wir haben experimentell gezeigt, dass diese Umfaltung zur Inhibition der Translation führt. Damit ist SR4 das 1. bifunktionelle Typ I-Antitoxin: SR4 fördert den Abbau von bsrG-RNA und hemmt die Inititiation der bsrG-Translation.
Zellbiologische Untersuchungen mittels hochauflösenden mikroskopischen Techniken zeigten, das das Typ I-Toxin BsrG unerwarteterweise nicht das Membranpotential beeinflusst, d. h. keine Poren in der Membran induziert, sondern Membraneinstülpungen bewirkt, die zu einer Delokalisation des Zellwandsyntheseapparates führen, die zum Tod der Zellen führen. Zur Zeit laufen in einer Kooperation Vorversuche zur Aufklärung der Struktur von BsrG in künstlichen Phospholipid-Membranen.
Seit kurzem untersuchen wir zwei weitere Typ I-TA-Systeme aus dem B. subtilis-Chromosom, bsrE/SR5 und yonT/as-yonT. Dabei unterscheidet sich bsrE/SR5 von bsrG/SR4 in bezug auf Expressionsprofil, Toxizität, intrazelluläre Konzentration von Toxin-mRNA sowie RNA-Antitoxin sowie im Wirkungsmechanismus des Antitoxins. Die Sekundärstrukturen von Antitoxin und Toxin-mRNA sowie des Komplexes aus beiden RNAs wurden bereits aufgeklärt und ähneln denen von SR4 und bsrG RNA. Im Unterschied zu bsrG/SR4 sind andere RNasen am Abbau von Toxin-mRNA und Antitoxin beteiligt, und das Antitoxin bewirkt nur die Destabilisierung der Toxin-mRNA, aber hat keinen Einfluss auf die Translation. BsrE ist weit weniger toxisch als BsrG. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass die Menge an bsrG-RNA nur durch Temperaturschock, die von bsrE-RNA dagegen durch viele verschiedene Stressfaktoren reguliert wird. Die Analyse von yonT/as-yonT, die vor kurzem begonnen wurde, zeigt eine sehr hohe Toxizität von YonT, aber eine sehr geringe Expression von Toxin- und Antitoxin-RNAs.

RNA-bindende Proteine

Im Zusammenhang mit der Untersuchung von SR1 sowie des TA-Systems bsrE/SR5  sind wir auf zwei RNA-bindende Proteine gestoßen, die im Focus künftiger Untersuchungen stehen werden. Interessanterweise spielt das abundante RNA-bindende Protein Hfq, das bei vielen trans-kodierten sRNAs in Gram-negativen Bakterien von Bedeutung ist, in Bacillus subtilis offenbar keine Rolle.

Transkriptionsfaktoren

Unser zweiter Schwerpunkt ist die Analyse und biochemische Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren in Gram-positiven Bakterien. Über viele Jahre hinweg haben wir den plasmidkodierten Transkriptionsrepressor CopR untersucht, der gemeinsam mit einer Antisense-RNA (RNAIII) die Replikation des konjugativen Streptokokkenplasmides pIP501 inhibiert. Plasmid pIP501 ist ein unidirektional nach dem theta-Mechanismus replizierendes Plasmid mit breitem Wirtsbereich innerhalb der grampositiven Bakterien. In der Replikationsregion befinden sich 2 offene Leserahmen, repR und copR, die für das essenzielle Replikationsinitiatorprotein RepR (MW 57.4 kD) und das nichtessenzielle CopR (10.4 kD) kodieren. Die RepR-Synthese wird negativ durch zwei Komponenten - die Antisense-RNA (RNAIII) und das CopR-Protein -  reguliert. Ihre Deletion bewirkt eine 10fache Erhöhung der Plasmidkopiezahl.

TranskriptionsattenuierungDie antisense-RNA übt ihre Wirkung über einen Transkriptionsattenuierungs-Mechanismus aus. CopR wirkt dagegen als Transkriptionsrepressor am repR-Promotor pII. Es wurde international erstmalig die Inhibitionskonstante einer antisense-RNA berechnet. Diese Konstante ist mit ca. 1x106 M-1 s-1 eine Größenordnung höher als die Paarungs-konstante zwischen Sense- und Antisense-RNA (1x105 M-1 s-1), was darauf hindeutet, dass die Inhibition schneller erfolgt als die stabile Paarung (Duplexbildung) zwischen Inhibitor- und Target-Molekül. Eine intrazelluläre Quantifizierung sowie Bestimmung der Halbwertszeiten von Wildtyp-Antisense- und Sense-RNA wurde erstmalig für ein in grampositiven Bakterien replizierendes Plasmid durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass die antisense-RNA eine ungewöhnlich lange Halbwertszeit von 30 min aufweist. Eine Hypothese, die ein Zusammenspiel von RNAIII und CopR mit einer doppelten Funktion vorsieht, wurde aufgestellt und experimentell verifiziert, die erklärt, wie eine solch außerordentlich stabile antisense-RNA trotzdem ihrer Kontrollfunktion in der Plasmid-Replikation nachkommen kann. Eine Anzahl von stem-loop-Mutanten der Antisense-RNA wurde konstruiert, die zu einer erwarteten Erhöhung der Kopiezahl der betreffenden pIP501-Derivate in vivo führten. Sie ließen sich in zwei Klassen einteilen: 1) Halbwertszeitmutanten und 2) Interaktions- mutanten. Letztere gestatteten die Identifizierung des Erkennungs-'loops', das vermutlich an ersten, geschwindigkeitsbestimmenden Wechselwirkungen zwischen sense- und antisense-RNA beteiligt ist. Außerdem konnten wir zeigen, dass ein U-turn-Motiv (5' YUNR) am 5'-terminalen Loop der Sense-RNA von pIP501 eine entscheidende Rolle für die effiziente Interaktion mit der Antisense-RNA und damit für die Regulation der Kopiezahl von pIP501 spielt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Interaktion zwischen Sense- und Antisense RNA nur zu einer partiellen Duplex zwischen beiden Molekülen führt. CopR liegt als Dimer vor und bindet als Dimer an die DNA. Durch eine Kombination von chemischen Interferenz-Footprintingmethoden wurde der Consensusbindungsort von CopR an seinen zwei Halbseiten mit 5' CGTG identifiziert. Die DNA-Bindungskonstante wurde mit 0.4 nM und die Dimerisierungskonstante mit 1.4 µM bestimmt. Die intrazelluläre Konzentration von  CopR beträgt 20-30 µM. Eine Kombination von Strukturmodellierung und Mutationsanalysen wurde verwendet, um funktionelle Motife in CopR zu ermitteln. Dabei wurde das DNA-Bindungsmotiv (ein HTH-Motiv) zwischen Aminosäuren 29 und 37 in der 2. α-Helix lokalisiert, während die an der Dimerisierung beteiligten Aminosäurereste zwischen Ile44 und Leu62 lagen. Die C-terminalen 29 Aminosäuren von CopR waren weder für DNA-Bindung noch für die Dimerisierung von Bedeutung. Sie konnten ohne Funktionsverlust in vivo deletiert werden. Der Austausch von 7 Glu-Resten innerhalb der 20 C-terminalen Aminosäuren durch Lys-Reste reduzierte die Stabilität des Proteins drastisch, wodurch gezeigt werde konnte, dass der saure C-Terminus für die Stabilisierung von CopR benötigt wird. FRET-Messungen zeigten, dass CopR bei Bindung an die DNA diese leicht (um (25 grd) biegt. SELEX-Experimente mit randomisierten CopR- Operatorregionen zeigte, dass die Evolution von CopR auf eine maximale Bindungsaffinität ausgerichtet war. CopR inhibiert die Bindung der RNA-Polymerase an den repR-Promotor, nicht jedoch die nachfolgenden Schritte der Transkriptionsinitiation (wie 'open complex formation' oder 'promoter escape').

 

Detailliert untersuchten wir den Transkriptionsrepressor CcpN aus dem B. subtilis-Genom, der die Transkription der kleinen RNA SR1 unter glykolytischen Bedingungen 20-30fach reprimiert. Dabei wurde zunächst eine Consensussequenz für die Bindung von CcpN abgeleitet. Chemisches Interferenz-Footprinting identifizierte die Basen im CcpN-Operator, die von CcpN kontaktiert werden. Durch quantitatives DNaseI - Footprinting und Gelshift-Analysen wurde gezeigt, dass CcpN durch kooperative Bindung an seinen beiden Bindungsorten die asymmetrische Kontaktverteilung kompensiert. Jüngst konnten wir die Liganden, die die Aktivität von CcpN modulieren, identifizieren: sowohl ATP als auch leicht saurer pH-Wert sind für die CcpN-vermittelte Transkriptionsrepression notwendig, Bedingungen, die während der Glycolyse auftreten.

Der Repressionsmechanismus von CcpN wurde aufgeklärt. Dabei stellte sich heraus, dass CcpN unterschiedliche Repressionsmechanismen an verschiedenen Promotoren verwendet (s. Abb.). Dabei interagiert CcpN mit der alpha-Untereinheit der B. subtilis-RNA-Polymerase.

CcpN

Derzeit untersuchen wir die drastische Verringerung der SR1-Menge bei Kälteschock mittels Northernblotting. Dabei  haben wir ein neues Triggerenzym entdeckt, das diese Kälteschock-Repression teilweise aufheben kann.

 

Diesen Text als PDF speichern  letzte Änderung: 20. 5. 2016